Уважаемые пользователи!

Данный сайт содержит информацию для людей с медицинским образованием и специалистов здравоохранения.
Входя на сайт, Вы подтверждаете свое согласие с Условиями использования и Политикой конфиденциальности.



Dear visitor!
This site contains medical information for healthcare professionals.
You can go further, if you agree with Terms and Conditions and Privacy Policy on this site.

Polimorfizm gena CTLA4 (49A/G) v russkoy populyatsii u bol'nykh sakharnym diabetom 1 tipa i zdorovykh donorov

Cover Page

Abstract


Цель. Изучение распространения полиморфизма 49A/G гена CTLA4 (rs231775) в русской популяции у больных CД 1 и у здоровых доноров. Материалы и методы. В исследовании использовали коллекции периферической крови детей в возрасте 5?12 лет с диагнозом СД 1 (50 образцов) и здоровых доноров крови (71 образец). ДНК выделяли методом Higuchi. Для генотипирования по локусам HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 применяли наборы реагентов производства НПФ ДНК-Технология. Полимеразную цепную реакцию проводили в 35 мкл амплификационной смеси, содержащей 5 мкл образца ДНК. Результаты. Частота аллеля A для здоровых доноров составила 60%, для больных СД 1 ? 43%. Частота аллеля G для здоровых доноров составила 40%, для больных СД 1 ? 57%. Различия межде группами статистически значимы. Частота генотипа AA для здоровых доноров составила 35%, для больных СД 1 ? 26%. Частота генотипа AG для здоровых доноров составила 51%, для больных СД 1 ? 34%. Частота генотипа GG для здоровых доноров составила 14%, для больных СД 1 ? 40%. Заключение. Полученные для русской популяции (дети) данные показывают, что гуанин в 49-й позиции нуклеотидной последовательности первого экзона гена CTLA4 ассоциирован с СД 1.

Сахарный диабет 1 типа (СД 1) – аутоиммунное заболевание, существенная роль в развитии которого принадлежит наследственной предрасположенности. Генетически обусловленная предрасположенность к развитию СД 1 связана в основном с полиморфизмом региона HLA класса II, однако существует целый ряд не относящихся к HLA генов, полиморфизм которых также может быть связан с развитием СД 1. Одним из генов-кандидатов является ген CTLA4 (cytotoxic T-lymdivhocyte associated antigen-4, поверхностный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов), белковый продукт которого участвует в регуляции активности Т-лимфоцитов и, следовательно, может играть важную роль в развитии аутоиммунных процессов. Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33, содержит 4 экзона и три интрона; полиморфизм гена обусловлен, в частности, полиморфизмом одиночного нуклеотида (SNP) +49A/G в первом экзоне (замена аденина на гуанин в 49 позиции последовательности первого экзона, приводящая к замене треонина на аланин в 17 позиции аминокислотной последовательности белка).
При исследовании различных популяций были получены данные, как подтверждающие [1–6], так и не подтверждающие [7–9] ассоциацию СД 1 с полиморфизмом +49 A/G гена CTLA4.
В данной статье представлены результаты работы по изучению распространения полиморфизма 49A/G гена CTLA4 (rs231775) в русской популяции у больных CД 1 и у здоровых доноров.

Материалы и методы исследования

В исследовании использовали коллекции периферической крови детей в возрасте 5–12 лет с диагнозом СД 1 (50 образцов, москвичи) и здоровых доноров крови (71 образец, москвичи).
ДНК выделяли методом Higuchi (1989) с некоторыми модификациями: 0,5 мл крови, взятой на EDTA, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках с 0,5 мл лизирующего раствора (0,32М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100) и центрифугировали в течение 1 мин при 10 000 об./мин. Супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза отмывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора (50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5 мМ MgCl, 0,45% NP40, 045% Твин 20 и 250 мкг/мл протеиназы К) при 37°С в течение 20 мин. Протеиназу К инактивировали кипячением в течение 5 мин в водяной бане. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при –20°С. Концентрация ДНК, определяемая по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США) составляла в среднем 50–100 мкг/мл.
Для генотипирования по локусам HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 применяли наборы реагентов производства НПФ ДНК-Технология (Москва).
Для детекции однонуклеотидной замены 49 A/G (rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 был применен метод сиквенс-специфических праймеров с определением продуктов амплификации в режиме «реального времени» [10].
Равное количество ДНК, выделенной из каждого образца, вносили в две амплификационные пробирки, содержащие праймер специфичный для аллеля A (пробирка с амплификационной смесью № 1) или аллеля G (пробирка с амплификационной смесью № 2), амплификационные смеси также содержали одинаковый обратный праймер и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.
Учет результатов проводили после окончания реакции амплификации. Результат генотипирования определяли по разнице пороговых циклов (ΔCt), полученных для амплификационных смесей № 1 и № 2. В случае гетерозиготы ΔCt была близка к нулю, в случае гомозигот ΔCt составляла более 5.
Для детекции однонуклеотидной замены 49 A/G (rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 были разработаны и синтезированы следующие праймеры: специфичный для аллеля A (5’- CAA ggC TCA gCT gAA CCT ggC TA –3’); специфичный для аллеля G (5’- CAA ggC TCA gCT gAA CCT ggC Tg –3’); общий праймер (5’- TCA CTg CCC TTg ACT gCT gAA ACA -3’). Также был синтезирован флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (FAM-5’- ggA CCT ggC CCT gCA CTC TCC Tg -3’-BHQ1). При разработке дизайна олигонуклеотидовов использовались базы данных нуклеотидных последовательностей Gen Bank, dbSNP и программное обеспечение Oligo 6.0.
Полимеразную цепную реакцию проводили в 35 мкл амплификационной смеси, содержащей 5 мкл образца ДНК и следующие компоненты: праймеры, специфичные для различных аллелей (14divM), общий праймер (14divM), флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (7 divM); 6 mM каждого dNTP; 84 mM TRIS-HCl (divH 8,6); 21 mM (NH4)2SO4; 3,1 mM – MgCl2, а также 5 единиц Taq-полимеразы. В целях повышения специфичности реакции применялся восковой «горячий старт».
Амплификацию и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью детектирующего амплификатора «ДТ-322» производства «НПФ ДНК-Технология». Температурный режим амплификации был следующим: денатурация при 94°C – 5 сек, отжиг, элонгация и детекция флуоресценции при 60°C – 20 сек (50 циклов).
Сравнение частот аллелей и генотипов для исследуемых групп проводилось с использованием точного критерия Фишера с применением поправки Бонферони.

Результаты и их обсуждение

Частота аллеля A для здоровых доноров составила 60%, для больных СД 1 – 43%. Частота аллеля G для здоровых доноров составила 40%, для больных СД 1 – 57%. Различия межде группами статистически значимы (P<0,01) (табл. 1).
Частота генотипа AA для здоровых доноров составила 35%, для больных СД 1 – 26%. Частота генотипа AG для здоровых доноров составила 51%, для больных СД 1 – 34%. Частота генотипа GG для здоровых доноров составила 14%, для больных СД 1 – 40% (различия статистически значимы) (табл. 2). Отклонения от равновесия Харди–Вайнберга в исследованных популяциях были незначительны.
Необходимо отметить следующее: ген CTLA4 был представлен генотипом 49GG у 7 из 10 больных СД 1, не несущих ни одного из «классических» маркерных гаплотипов HLA (DRB1*04-DQA1*301-DQB1*302 и DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201). В то же время генотип CTLA4 49A/G был обнаружен лишь у 6 из 52 здоровых доноров, не несущих ни одного из «классических» маркерных гаплотипов HLA.
В качестве практических рекомендаций можно предложить для формирования в детском возрасте групп «повышенного риска» по развитию СД 1, наряду с изучением полиморфизма HLA класса II, проводить изучение полиморфизма +49A/G гена CTLA4 (rs231775).

Выводы

Полученные для русской популяции (дети) данные показывают, что гуанин в 49-й позиции нуклеотидной последовательности первого экзона гена CTLA4 ассоциирован с СД 1.

D D Abramov

ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России», Москва

Ivan Ivanovich Dedov

Endocrinology Research Centre, Moscow

D Yu Trofimov

ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва

M N Boldyreva

ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России», Москва

Tamara Leonidovna Kuraeva

ФГУ Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий, Москва

L P Alekseev

ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России», Москва

  1. Krokowski M., Bodalski J., Bratek A., Machejko P., Caillat-Zucman S. CTLA-4 gene polymorphism is associated with predisposition to IDDM in a population from central Poland.// Diabetes Metab. 1998.
  2. Chistiakov D.A., Savost'anov K.V., Nosikov V.V. CTLA4 gene polymorphisms are associated with, and linked to, insulin-dependent diabetes mellitus in a Russian population.// BMC Genet. 2001.
  3. Guja C., Marshall S., Welsh K., Merriman M., Smith A., Todd J.A., Ionescu- T rgoviste C. The study of CTLA-4 and vitamin D receptor polymorphisms in the Romanian type 1 diabetes population.// J Cell Mol Med. 2002
  4. Fajardy I., Vambergue A., Stuckens C., Weill J., Danze P.M., Fontaine P. CTLA-4 49 A/G dimorphism and type 1 diabetes susceptibility: a French case-control study and segregation analysis. Evidence of a maternal effect.//Eur J Immunogenet. 2002.
  5. Mochizuki M., Amemiya S., Kobayashi K., Kobayashi K., Shimura Y., Ishihara T., Nakagomi Y., Onigata K., Tamai S., Kasuga A., Nanazawa S. Association of the CTLA-4 gene 49 A/G polymorphism with type 1 diabetes and autoimmune thyroid disease in Japanese children. Diabetes Care. 2003.
  6. Kavvoura F.K., Ioannidis J.P. CTLA-4 gene polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes mellitus: a HuGE Review and meta-analysis.// Am J Epidemiol. 2005.
  7. Yanagawa T., Maruyama T., Gomi K., Taniyama M., Kasuga A., Ozawa Y., Terauchi M., Hirose H., Maruyama H., Saruta T. Lack of association between CTLA-4 gene polymorphism and IDDM in Japanese subjects.//Autoimmunity. 1999.
  8. Cinek O., Drev nek P., Sumn k Z., Bendlov B., Kolouskov S., Snajderov M., Vavrinec J. The CTLA4 +49 A/G dimorphism is not associated with type 1 diabetes in Czech children.// Eur J Immunogenet. 2002
  9. I.I. Dedov, L.I. Kolesnikova, T.P. Bardimova et all. Рolymorphism of CTLA4(49 A/G) gene in patients of buryat population with the 1 type diabetes // The 13-th International Congress on circumpolar health: The abstract booc., June 12-16, 2006.-Novosibirsk., 2006.-P.63.
  10. И.А. Кофиади, Д.В. Ребриков. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфическая ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой. // Генетика, 2006, том 42, №1, с 22-32.

Views

Abstract - 854

PDF (Russian) - 750

Cited-By


PlumX


Copyright (c) 2007 Abramov D.D., Dedov I.I., Trofimov D.Y., Boldyreva M.N., Kuraeva T.L., Alekseev L.P.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.