Polimorfizm gena CTLA4 (49A/G) v russkoy populyatsii u bol'nykh sakharnym diabetom 1 tipa i zdorovykh donorov

Cover Page
  • Authors: Abramov DD1, Dedov I.I.2, Trofimov DY.3, Boldyreva MN1, Kuraeva T.L.4, Alekseev LP1
  • Affiliations:
    1. ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России», Москва
    2. Endocrinology Research Centre, Moscow
    3. ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва
    4. ФГУ Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий, Москва
  • Issue: Vol 10, No 3 (2007)
  • Pages: 2-3
  • Section: Articles
  • URL: https://dia-endojournals.ru/dia/article/view/5989
  • DOI: https://doi.org/10.14341/2072-0351-5989
  • Cite item

Abstract


Цель. Изучение распространения полиморфизма 49A/G гена CTLA4 (rs231775) в русской популяции у больных CД 1 и у здоровых доноров. Материалы и методы. В исследовании использовали коллекции периферической крови детей в возрасте 5?12 лет с диагнозом СД 1 (50 образцов) и здоровых доноров крови (71 образец). ДНК выделяли методом Higuchi. Для генотипирования по локусам HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 применяли наборы реагентов производства НПФ ДНК-Технология. Полимеразную цепную реакцию проводили в 35 мкл амплификационной смеси, содержащей 5 мкл образца ДНК. Результаты. Частота аллеля A для здоровых доноров составила 60%, для больных СД 1 ? 43%. Частота аллеля G для здоровых доноров составила 40%, для больных СД 1 ? 57%. Различия межде группами статистически значимы. Частота генотипа AA для здоровых доноров составила 35%, для больных СД 1 ? 26%. Частота генотипа AG для здоровых доноров составила 51%, для больных СД 1 ? 34%. Частота генотипа GG для здоровых доноров составила 14%, для больных СД 1 ? 40%. Заключение. Полученные для русской популяции (дети) данные показывают, что гуанин в 49-й позиции нуклеотидной последовательности первого экзона гена CTLA4 ассоциирован с СД 1.

Сахарный диабет 1 типа (СД 1) – аутоиммунное заболевание, существенная роль в развитии которого принадлежит наследственной предрасположенности. Генетически обусловленная предрасположенность к развитию СД 1 связана в основном с полиморфизмом региона HLA класса II, однако существует целый ряд не относящихся к HLA генов, полиморфизм которых также может быть связан с развитием СД 1. Одним из генов-кандидатов является ген CTLA4 (cytotoxic T-lymdivhocyte associated antigen-4, поверхностный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов), белковый продукт которого участвует в регуляции активности Т-лимфоцитов и, следовательно, может играть важную роль в развитии аутоиммунных процессов. Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33, содержит 4 экзона и три интрона; полиморфизм гена обусловлен, в частности, полиморфизмом одиночного нуклеотида (SNP) +49A/G в первом экзоне (замена аденина на гуанин в 49 позиции последовательности первого экзона, приводящая к замене треонина на аланин в 17 позиции аминокислотной последовательности белка).
При исследовании различных популяций были получены данные, как подтверждающие [1–6], так и не подтверждающие [7–9] ассоциацию СД 1 с полиморфизмом +49 A/G гена CTLA4.
В данной статье представлены результаты работы по изучению распространения полиморфизма 49A/G гена CTLA4 (rs231775) в русской популяции у больных CД 1 и у здоровых доноров.

Материалы и методы исследования

В исследовании использовали коллекции периферической крови детей в возрасте 5–12 лет с диагнозом СД 1 (50 образцов, москвичи) и здоровых доноров крови (71 образец, москвичи).
ДНК выделяли методом Higuchi (1989) с некоторыми модификациями: 0,5 мл крови, взятой на EDTA, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках с 0,5 мл лизирующего раствора (0,32М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100) и центрифугировали в течение 1 мин при 10 000 об./мин. Супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза отмывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора (50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5 мМ MgCl, 0,45% NP40, 045% Твин 20 и 250 мкг/мл протеиназы К) при 37°С в течение 20 мин. Протеиназу К инактивировали кипячением в течение 5 мин в водяной бане. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при –20°С. Концентрация ДНК, определяемая по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США) составляла в среднем 50–100 мкг/мл.
Для генотипирования по локусам HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 применяли наборы реагентов производства НПФ ДНК-Технология (Москва).
Для детекции однонуклеотидной замены 49 A/G (rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 был применен метод сиквенс-специфических праймеров с определением продуктов амплификации в режиме «реального времени» [10].
Равное количество ДНК, выделенной из каждого образца, вносили в две амплификационные пробирки, содержащие праймер специфичный для аллеля A (пробирка с амплификационной смесью № 1) или аллеля G (пробирка с амплификационной смесью № 2), амплификационные смеси также содержали одинаковый обратный праймер и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.
Учет результатов проводили после окончания реакции амплификации. Результат генотипирования определяли по разнице пороговых циклов (ΔCt), полученных для амплификационных смесей № 1 и № 2. В случае гетерозиготы ΔCt была близка к нулю, в случае гомозигот ΔCt составляла более 5.
Для детекции однонуклеотидной замены 49 A/G (rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 были разработаны и синтезированы следующие праймеры: специфичный для аллеля A (5’- CAA ggC TCA gCT gAA CCT ggC TA –3’); специфичный для аллеля G (5’- CAA ggC TCA gCT gAA CCT ggC Tg –3’); общий праймер (5’- TCA CTg CCC TTg ACT gCT gAA ACA -3’). Также был синтезирован флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (FAM-5’- ggA CCT ggC CCT gCA CTC TCC Tg -3’-BHQ1). При разработке дизайна олигонуклеотидовов использовались базы данных нуклеотидных последовательностей Gen Bank, dbSNP и программное обеспечение Oligo 6.0.
Полимеразную цепную реакцию проводили в 35 мкл амплификационной смеси, содержащей 5 мкл образца ДНК и следующие компоненты: праймеры, специфичные для различных аллелей (14divM), общий праймер (14divM), флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (7 divM); 6 mM каждого dNTP; 84 mM TRIS-HCl (divH 8,6); 21 mM (NH4)2SO4; 3,1 mM – MgCl2, а также 5 единиц Taq-полимеразы. В целях повышения специфичности реакции применялся восковой «горячий старт».
Амплификацию и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью детектирующего амплификатора «ДТ-322» производства «НПФ ДНК-Технология». Температурный режим амплификации был следующим: денатурация при 94°C – 5 сек, отжиг, элонгация и детекция флуоресценции при 60°C – 20 сек (50 циклов).
Сравнение частот аллелей и генотипов для исследуемых групп проводилось с использованием точного критерия Фишера с применением поправки Бонферони.

Результаты и их обсуждение

Частота аллеля A для здоровых доноров составила 60%, для больных СД 1 – 43%. Частота аллеля G для здоровых доноров составила 40%, для больных СД 1 – 57%. Различия межде группами статистически значимы (P<0,01) (табл. 1).
Частота генотипа AA для здоровых доноров составила 35%, для больных СД 1 – 26%. Частота генотипа AG для здоровых доноров составила 51%, для больных СД 1 – 34%. Частота генотипа GG для здоровых доноров составила 14%, для больных СД 1 – 40% (различия статистически значимы) (табл. 2). Отклонения от равновесия Харди–Вайнберга в исследованных популяциях были незначительны.
Необходимо отметить следующее: ген CTLA4 был представлен генотипом 49GG у 7 из 10 больных СД 1, не несущих ни одного из «классических» маркерных гаплотипов HLA (DRB1*04-DQA1*301-DQB1*302 и DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201). В то же время генотип CTLA4 49A/G был обнаружен лишь у 6 из 52 здоровых доноров, не несущих ни одного из «классических» маркерных гаплотипов HLA.
В качестве практических рекомендаций можно предложить для формирования в детском возрасте групп «повышенного риска» по развитию СД 1, наряду с изучением полиморфизма HLA класса II, проводить изучение полиморфизма +49A/G гена CTLA4 (rs231775).

Выводы

Полученные для русской популяции (дети) данные показывают, что гуанин в 49-й позиции нуклеотидной последовательности первого экзона гена CTLA4 ассоциирован с СД 1.

D D Abramov

ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России», Москва

Ivan Ivanovich Dedov

Endocrinology Research Centre, Moscow

D Yu Trofimov

ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва

M N Boldyreva

ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России», Москва

Tamara Leonidovna Kuraeva

ФГУ Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий, Москва

L P Alekseev

ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России», Москва

  1. Krokowski M., Bodalski J., Bratek A., Machejko P., Caillat-Zucman S. CTLA-4 gene polymorphism is associated with predisposition to IDDM in a population from central Poland.// Diabetes Metab. 1998.
  2. Chistiakov D.A., Savost'anov K.V., Nosikov V.V. CTLA4 gene polymorphisms are associated with, and linked to, insulin-dependent diabetes mellitus in a Russian population.// BMC Genet. 2001.
  3. Guja C., Marshall S., Welsh K., Merriman M., Smith A., Todd J.A., Ionescu- T rgoviste C. The study of CTLA-4 and vitamin D receptor polymorphisms in the Romanian type 1 diabetes population.// J Cell Mol Med. 2002
  4. Fajardy I., Vambergue A., Stuckens C., Weill J., Danze P.M., Fontaine P. CTLA-4 49 A/G dimorphism and type 1 diabetes susceptibility: a French case-control study and segregation analysis. Evidence of a maternal effect.//Eur J Immunogenet. 2002.
  5. Mochizuki M., Amemiya S., Kobayashi K., Kobayashi K., Shimura Y., Ishihara T., Nakagomi Y., Onigata K., Tamai S., Kasuga A., Nanazawa S. Association of the CTLA-4 gene 49 A/G polymorphism with type 1 diabetes and autoimmune thyroid disease in Japanese children. Diabetes Care. 2003.
  6. Kavvoura F.K., Ioannidis J.P. CTLA-4 gene polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes mellitus: a HuGE Review and meta-analysis.// Am J Epidemiol. 2005.
  7. Yanagawa T., Maruyama T., Gomi K., Taniyama M., Kasuga A., Ozawa Y., Terauchi M., Hirose H., Maruyama H., Saruta T. Lack of association between CTLA-4 gene polymorphism and IDDM in Japanese subjects.//Autoimmunity. 1999.
  8. Cinek O., Drev nek P., Sumn k Z., Bendlov B., Kolouskov S., Snajderov M., Vavrinec J. The CTLA4 +49 A/G dimorphism is not associated with type 1 diabetes in Czech children.// Eur J Immunogenet. 2002
  9. I.I. Dedov, L.I. Kolesnikova, T.P. Bardimova et all. Рolymorphism of CTLA4(49 A/G) gene in patients of buryat population with the 1 type diabetes // The 13-th International Congress on circumpolar health: The abstract booc., June 12-16, 2006.-Novosibirsk., 2006.-P.63.
  10. И.А. Кофиади, Д.В. Ребриков. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфическая ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой. // Генетика, 2006, том 42, №1, с 22-32.

Views

Abstract - 885

PDF (Russian) - 801

Cited-By


PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2007 Abramov D.D., Dedov I.I., Trofimov D.Y., Boldyreva M.N., Kuraeva T.L., Alekseev L.P.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies