The respiratory explosion activity of neutrophils in blood from patients with Graves' disease manifestation

Cover Page

Abstract


 

Objective. To study respiratory burst activity in neutrophilic granulocytes in the onset of Graves’ disease (GD).

Material and methods. Twenty-six females aged 18—55 years (mean age, 40.7±13.2 years), with the diagnosis of Graves’ disease verified for the first time, were enrolled in this study. Spontaneous and zymosan-induced chemiluminescence (CL) was assessed using a CL3606 36-channel analyzer for 90 min. The following parameters of the chemiluminescence curve were determined: time to attain the maximum (Tmax), the maximum intensity (Imax), and the area under the curve (S).

Results. Patients with GD and lucigenin-dependent CL of neutrophils exhibited decreased zymosan-induced CL and the increased Imax of luminol-dependent spontaneous and zymosan-induced CL of neutrophils. Association between the anti-TPO level in blood serum with Tmax (r=–0,70; р=0.036) and Imax of luminol-dependent induced CL (r=–0.72; р=0.030) was found. The maximum level of synthesis of secondary reactive oxygen species (ROS) was found to be elevated in patients with GP both at relative rest and upon antigen-induced respiratory burst.

Conclusion. In patients with GD, respiratory burst activity in neutrophils increases due to synthesis of secondary reactive oxygen species. Upon the onset of GD, already at the stage of subclinical thyrotoxicosis, the association between the indices of respiratory burst in neutrophils and thyroid hormones is lost but there emerges a relationship between the CL response and anti-TPO concentration.


По современным представлениям, болезнь Грейвса (БГ) представляет собой аутоиммунное заболевание, характеризующееся диффузным гиперпластическим зобом, которое обусловлено активацией рецепторов ТТГ тиреостимулирующими антителами [1]. Результатом нарушения функционального состояния щитовидной железы (ЩЖ) и активности тиреоидспецифического гуморального иммунитета является гибель тиреоидной паренхимы [2—4]. Признание аутоиммунной природы БГ определило поиски наиболее информативных маркеров, участвующих в реакциях гуморального и клеточного иммунитета. Нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются ключевыми эффекторными и регуляторными клетками врожденного иммунитета и играют решающую роль в иммунопатогенезе широкого спектра заболеваний. НГ обладают мощным рецепторным потенциалом, обеспечивающим связь с другими клетками иммунной системы [5]. Роль НГ в иммунопатогенезе БГ остается малоизученной. Известно, что НГ способны продуцировать ряд цитокинов, избыток которых усиливает интратиреоидный воспалительный процесс [6]. Вовлечение НГ в процесс деструкции ЩЖ сопровождается усилением потребления клетками кислорода и продукцией его токсичных метаболитов (респираторный взрыв), что в условиях дефекта механизмов антиоксидантной защиты может служить причиной включения летальной программы как иреоидных клеток, так и самих полиморфно-ядерных лейкоцитов [7, 8].

Цель — изучить активность респираторного взрыва НГ крови в дебюте БГ.

Материал и методы

В исследование были включены 26 женщин в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 40,7±13,2 года) с впервые верифицированным диагнозом БГ до начала тиреостатической терапии. В качестве контроля обследованы 35 практически здоровых женщин аналогичного возраста без отягощенного семейного анамнеза по заболеваниям ЩЖ и отсутствием структурных изменений ЩЖ при УЗИ. Диагноз БГ основывался на жалобах, клинической картине тиреотоксикоза, сонографических изменениях ЩЖ, а также на повышенном титре антител к рецептору ТТГ (АТ-рТТГ) в сыворотке крови и соответствующих изменениях тиреоидного статуса [9]. Определение гормонов в крови проводилось в гормональной лаборатории эндокринологического центра Красноярской краевой клинической больницы (ККБ). Кровь из кубитальной вены брали между 8 и 9 ч утра после голодания в течение не менее 8 и не более 12 ч. Уровень гормонов определяли иммунорадиометрическим методом c помощью стандартных тест-наборов «Immunotech a.s., Beckman Coulter company» ( Чехия) для ТТГ Референсные показатели для ТТГ: 0,17—4,05 мЕд/л, для свободного (св.) Т4 — 11,5—23,0 пмоль/л. Уровень АТ-рТТГ оценивали иммуноферментным (ИФА) методом («Хема-Медика», Россия) с указанным референсным интервалом менее 1,0 МЕ/л. Дополнительно методом ИФА определяли концентрацию аутоантител к пероксидазе тиреоцитов (анти-ТПО) («Хема-Медика», Россия) с указанным референсным интервалом от 0 до 30 мЕд/л. Ультразвуковое исследование (УЗИ) ЩЖ проводили в отделении ультразвуковой диагностики ККБ на аппарате Aloka 3500 (Япония) линейным датчиком 7,5 МГц. Объем ЩЖ вычисляли по формуле: V=Vл.д. + Vпр.д, где Vл. (пр.)доли=(A×B×C) × 0,479; А — длина доли (см), B — ширина доли (см), С — высота (толщина) доли (см) [10]. Нормальный объем железы у женщин составлял до 18 мл. Критериями исключения из контрольной группы являлись беременность и лактация. В течение 2 мес, предшествующих иммунологическому и гормональному анализу, женщины не болели острыми респираторно-вирусными инфекциями и не получали профилактических прививок.

НГ выделяли из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см3 — для отделения лимфоцитов, ρ=1,119 г/см3 — для выделения НГ. Реакционная смесь для ХЛ реакции состояла из 20 мкл донорской сыворотки AB(IV)Rh(–), 50 мкл люцигенина или люминола («Sigma», США) в концентрации 10–5 М, 40 мкл опсонизированного зимозана (в случае определения индуцированной ХЛ), 200 мкл взвеси НГ (2 млн/мл) и 240 мкл раствора Хэнкса («ПанЭко», Россия) для определения спонтанной ХЛ или 200 мкл раствора Хенкса для индуцированной [11]. Выбор двух ХЛ-индикаторов определялся необходимостью выделения в общем пуле активных форм кислорода (АФК) (оценивается с помощью люминола) объема синтеза супероксид-радикала (определяется с помощью люцигенина). Спонтанную и зимозан-индуцированную ХЛ оценивали в течение 90 мин на 36-канальном ХЛ-анализаторе CL3606 (СКТБ «Наука», Красноярск). Определяли следующие характеристики ХЛ-кривой: время выхода на максимум (Тmax), характеризующее скорость развития ХЛ-реакции, максимальное значение интенсивности (Imax), отражающее максимальный уровень синтеза АФК, а также площадь под кривой (S), характеризующую суммарный синтез АФК за 90 мин исследования. Усиление ХЛ под действием зимозана оценивали по отношению площади индуцированной ХЛ к площади спонтанной и определяли как индекс активации.

Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых, в соответствии с этическими нормами Хельсинской Декларации (2001) и соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ №2288 от 24.12.93). Протокол исследования одобрен этическим комитетом КГБУЗ «ККБ» (Красноярск, ул. Партизана Железняка 3а, протокол №124, от 07.04.16).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 («StatSoftInc.», США). Проверка количественных данных на нормальность распределения проводилась с помощью теста Шапиро—Уилкса. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного интервала между 25-м и 75-м процентилями (Me [С25 — С75]).Значимость различий между показателями независимых выборок оценивали по непарамет рическому критерию Манна—Уитни. Анализ связи признаков проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r).

Результаты и обсуждение

Медиана уровня ТТГ и св. Т4 у больных в дебюте БГ составила соответственно 0,17 (0,01—0,72) мкмЕД/мл и 17,91 (13,12—30,32) пмоль/л, а содержание АТ-рТТГ и анти-ТПО — соответственно 16,81 (10,07—30,34) МЕ/л и 374 (223—817) мЕд/л. По данным УЗИ, медиана объема ЩЖ у больных составила 30,6 (20,41; 62,93) мл; в 24 (92,3%) случаях наблюдалось изменение структуры ЩЖ за счет чередования участков повышенной и пониженной эхогенности.

 

Хемилюминесцентная активность нейтрофилов у больных БГ (Ме, С25 — С75)

Показатель

Контроль (n=35)

БГ (n=26)

р

Me

C25—C75

Me

C25—C75

Люцигенин-зависимая спонтанная хемилюминесценция

Tmax, с

2103

1407—2881

1740

1445—2297

 

Imax, отн.ед. × 103

7,51

2,55—16,63

6,75

2,21—20,50

 

S, отн.ед. с 106

15,42

3,85—41,11

8,39

1,17—52,23

 

Люцигенин-зависимая зимозан-индуцированная хемилюминесценция

Tmax, с

1737

1345—2331

1365

1023—1884

0,018

Imax, отн.ед. × 103

14,05

7,43—29,49

15,98

5,39—25,84

 

S, отн.ед. с 106

24,85

10,70—65,54

19,04

18,14—77,29

 

Sинд/Sспонт.

1,78

1,17—3,13

1,70

1,12—4,07

 

Люминол-зависимая спонтанная хемилюминесценция

Tmax, с

998

548—1694

1345,5

986—2096

 

Imax, отн.ед. × 103

15,98

5,10—40,24

41,09

7,25—76,37

0,015

S, отн.ед. с 106

22,53

5,62—87,73

55,56

5,95—108,90

 

Люминол-зависимая зимозан-индуцированная хемилюминесценция

Tmax, с

1030

777—1375

1164

737—1638

 

Imax, отн.ед. × 103

32,06

12,00—111,29

121,45

60,88—152,95

0,004

S, отн.ед. с 106

46,79

12,04—270,00

80,72

33,00—382,90

 

Sинд/Sспонт.

2,04

1,42—3,44

2,42

1,31—4,08

 
       

 

При исследовании люцигенин-зависимой ХЛ нейтрофилов крови обнаружено, что при БГ снижен Тmax зимозан-индуцированной ХЛ (см. таблицу). Выявлено также увеличение Imax люминол-зависимой спонтанной и зимозан-индуцированной ХЛ нейтрофилов.

Установлено, что у лиц контрольной группы концентрация ТТГ отрицательно коррелировала c Тmax люцигенин-зависимой спонтанной (r=–0,89; р=0,019) и индуцированной (r=–0,94; р=0,005) ХЛ. Концентрация св. Т4 также отрицательно коррелировала с Imax и S спонтанной люцигенин-зависимой ХЛ (r=–0,83; р=0,042, в обоих случаях), с Тmax (r=–0,84; р=0,041) и S (r=–0,94; р=0,004) зимозан-индуцированной люцигенин-зависимой ХЛ. У больных с БГ выявлены только корреляции между уровнем анти-ТПО с Тmax (r=–0,70; р=0,036) и Imax люминол-зависимой индуцированной (r=–0,72; р=0,030) ХЛ.

Люцигенин окисляется и люминесцирует только под влиянием супероксид-радикала, который определяется как первичная АФК и синтезируется в системе НАДФН-оксидазы [11, 12]. Люцигенин не проходит через мембрану клеток и связывается с супероксид-радикалом только во внеклеточном пространстве. Соответственно, исследование люцигенин-зависимой ХЛ нейтрофилов позволяет охарактеризовать состояние активности НАДФН-оксидазы и уровень выделения супероксид-радикала для реализации механизма внешнего киллинга. Единственной особенностью кинетики синтеза супероксид-радикала НГ у больных БГ явилось снижение Тmax индуцированной ХЛ. Тmax характеризует скорость развития респираторного взрыва в случае регуляторного или антигенного (АГ) воздействия на клетку — с периода восприятия сигнала и до уровня максимальной активации НАДФН-оксидазы [13]. Следовательно, у больных БГ в нейтрофилах крови скорость активации НАДФН-оксидазы при АГ стимуляции замедлена. Снижение Тmax в ходе индуцированной ХЛ при БГ и дебюте тиреотоксикоза также отражает нарушение окисления НАДФН [14], связанную с ним медленную активацию каспазного каскада и, как результат, отсроченную реализацию программы апоптотической гибели клетки. Примечательно, что у 18 (69,2%) больных с впервые установленным диагнозом БГ тиреоидный статус соответствовал субклиническому тиреотоксикозу. Однако даже в отсутствии манифестного тиреотоксикоза кинетика зимозан-индуцированного синтеза первичных АФК изменялась.

Цитотоксическая активность НГ определяется уровнем продукции как первичных, так и вторичных АФК (гидроксильный радикал, перекись водорода и др.). В формировании пула вторичных АФК в НГ принимают участие такие ферменты, как супер оксиддисмутаза, каталаза, миелопероксидаза и др. [6, 11, 13]. Люминол способен вступать в ХЛ-реак цию и с первичными, и с вторичными АФК, причем как во вне-, так и внутриклеточном пространстве и вступать в реакцию в фаголизосомах. Установлено, что при БГ в НГ повышен максимум уровня синтеза вторичных АФК как в состоянии относительного покоя, так и при антигенной индукции дыхательного взрыва.

Исходя из результатов корреляционного анализа, можно заключить, что при БГ значительно нарушена тиреоидная регуляция дыхательного взрыва в НГ. Так, если у лиц контрольной группы с кинетическими показателями синтеза супероксид-радикала коррелируют только ТТГ и св. Т4, то у больных БГ выявляются корреляционные взаимосвязи только между уровнем анти-ТПО и кинетическими параметрами синтеза вторичных АФК. Известно, что гормоны ЩЖ влияют на обменные процессы в клетках, преимущественно стимулируя энергетические процессы и реакции липидного обмена [15—17], что приводит к оттоку субстратов из пентозофосфатного цикла, в котором синтезируется НАДФН. Перераспределение субстратных потоков в обменных процессах НГ под влиянием тиреоидных гормонов отрицательно влияет на активность НАДФН-оксидазы и соответственно показатель люцигенин-зависимой ХЛ. В то же время органо-зависимый аутоиммунный процесс при БГ стимулирует выход активированных клеток иммунной системы из кровеносного русла и их миграцию в ткань ЩЖ. Поскольку интенсивность респираторного взрыва в НГ возрастает при функциональной активации клеток, можно заключить, что с увеличением уровня анти-ТПО при БГ количество активированных НГ в периферической крови будет снижаться. В целом у больных БГ в НГ крови повышается интенсивность респираторного взрыва за счет синтеза вторичных АФК. Кинетика синтеза первичных АФК меняется незначительно. Однако даже в отсутствии манифестного тиреотоксикоза (у части больных БГ с субклиническим тиреотоксикозом) Тmax синтеза первичных АФК замедляется. В случае дебюта БГ уже при субклиническом тиреотоксикозе и минимальных изменениях тиреоидного статуса взаимосвязи между показателями респираторного взрыва НГ и гормонами ЩЖ теряются, но появляется связь между ХЛ-реакцией и концентрацией анти-ТПО. Можно предположить, что с усилением аутоиммунных процессов снижается реактивность нейтрофилов крови за счет миграции активированных клеток в ткань ЩЖ.

Заключение

При БГ выявлены изменения механизмов, ответственных за реализацию кислородного метаболизма НГ крови, что может не только влиять на развитие цитопатогенного эффекта нейтрофилов при развитии аутоиммунного процесса, но и определять возможности тиреостатической терапии в дебюте заболевания. Дальнейшее изучение клинико-иммунологических маркеров как потенциальных прогностических факторов, указывающих на вероятность ремиссии и/или рецидива БГ после консервативной терапии, представляется перспективным направлением.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование проведено из личных средств авторов.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — С.А. Догадин, А.А. Савченко; сбор и обработка материала — М.А. Дудина, В.А. Маньковский, Гвоздев И.И.; статистическая обработка данных — А.А. Савченко, М.А. Дудина; написание текста — М.А. Дудина, В.А. Маньковский; редактирование — С.А. Догадин, А.А.Савченко

Sergey A. Dogadin

sadogadin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1709-466X
SPIN-code: 4803-3756
V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Regional Clinical Hospital
Russian Federation, 1 P.Zeleznyaka street, Krasnoyarsk, 660022 

MD, Professor of chair internal diseases №2 with postgraduate course , The Head of Krasnoyarsk regional endocrinology center

Margarita A. Dudina

Author for correspondence.
margo85_@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-2776-927X
SPIN-code: 4854-1926
V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Regional Clinical Hospital
Russian Federation, 1 P.Zeleznyaka street, Krasnoyarsk, 660022 

PhD, assistent of  internal diseases №2  chair  with postgraduate course, endocrinologyst of endocrinology department Krasnoyarsk clinical hospital

Andrey A. Savchenko

aasavchenko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5829-672X
SPIN-code: 3132-8260
V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Research Institute of Medical Problems of the North
Russian Federation, 1 P.Zeleznyaka street, Krasnoyarsk, 660022

 MD, Professor, The Head of  physiology  department named after Professor A. T. Pshonica the Krasnoyarsk state medical University im. after Professor V. F. Voyno-Yasenetsky, Krasnoyarsk, Russia.The Head of molecular and cell biology and physiology of Scientific Institution «Scientific Research Institute of medical problems of the North» 

Vladimir A. Mankovskiy

manvlad@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-4328-8054
SPIN-code: 9283-7490
Regional Clinical Hospital
Russian Federation, 3A P.Zeleznyaka street, Krasnoyarsk, 660022 

endocrinologyst surgeon

Ivan I. Gvozdev

leshman-mult@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1041-9871
SPIN-code: 6203-4651
Research Institute of Medical Problems of the North
Russian Federation, 3G P.Zeleznyaka street, Krasnoyarsk, 660022 

research assistant

  • Volpe R. Autoimmune Diseases of the endocrine system. CRC: Boca Raton; 1990.
  • Karandikar NJ, Vanderlugt CL, Walunas TL, et al. CTLA-4: a negative regulator of autoimmune disease. J Exp Med. 1996;184(2):783-788. PMC2192746.
  • Khan P, Idrees D, Moxley Ma, et al. Luminol-based chemiluminescent signals: clinical and non-clinical application and future uses. Appl Biochem Biotechnol. 2014;173(2):333-355. doi: 10.1007/s12010-014-0850-1.
  • Krieger CC, Neumann S, Place RF, et al. Bidirectional TSH and IGF-1 receptor cross talk mediates stimulation of hyaluronan secretion by Graves’ disease immunoglobins. J Clin Endocrinol Metab. 2015;100(3):1071-1077. doi: 10.1210/jc.2014-3566.
  • Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., и др. Нейтрофильные гранулоциты: новый взгляд на «старых игроков» на иммунологическом поле. // Иммунология. — 2015. — №4. — С. 257-265. [Nesterova IV, Kolesnikova NV, Chudilova GA, et al. Neutrophilic granulocytes: a new look at «old players» on the immunological field. Immunology. 2015;(4):257-265. (In Russ).].
  • Савченко А.А., Здзитовецкий Д.Э., Борисов А.Г. Иммунометаболические нарушения при распространенном гнойном перитоните. — Новосибирск: Наука; 2013. [Savchenko AA, Zdzitovetskiy DE, Borisov AG. Immune and metabolic disorders by the widespread purulent peritonitis. Novosibirsk: Nauka; 2013. (In Russ).].
  • Уразова О.И., Кравец Е.Б., Новицкий В.В., и др. Апоптоз нейтрофилов и иммунорегуляторные цитокины при аутоиммунных тиреопатиях. // Клиническая и экспериментальная тиреоидология. — 2007. — Т.3. — №4. — С. 49-53. [Urazova OI, Kravez EB, Novitskii VV, et al. The apoptosis of blood neutrophils and immunoregulatories cytokines in patients with autoimmune thyropaties. Clinical and experimental thyroidology. 2007;3(4):49-53. (In Russ).]. doi: 10.14341/ket20073449-53.
  • Дрометр Д.А., Тузанкина И.А., Кияев А.В. Иммунологические аспекты дифференциальной диагностики синдрома гипертиреоза. // Клиническая и экспериментальная тиреоидология. – 2007. — Т.3. — №1. — С. 18-23. [Drometr DA, Tuzankina IA, Kiyaev AV. Immunological aspects of differential diagnostics of hyperthyroidism. Clinical and experimental thyroidology. 2007;3(1):18-23. (In Russ).]. doi: 10.14341/ket20073118-23.
  • Трошина Е.А., Свириденко Н.Ю., Ванушко В.Э., и др. Федеральные клинические рекомендации Российской ассоциации эндокринологов по диагностике и лечению токсического зоба. // Клиническая и экспериментальная тиреоидология. — 2014. — Т. 10. — №3 — С. 8-19. [Troshina EA, Sviridenko NYu, Vanushko VE, et al. Russian association of endocrinologists clinical practice guidelines for thyrotoxicosis diagnosis and treatment. Clinical and experimental thyroidology. 2014;10(3):8-19. (In Russ.).]. doi: 10.14341/ket201438-19.
  • Brunn J, Block U, Ruf G, et al. Volumetric analysis of thyroid lobes by real-time ultrasound (author’s transl). Dtsch Med Wochenschr. 1981;106(41):1338-1340. doi: 10.1055/s-2008-1070506.
  • Шкапова Е.А., Куртасова Л.М., Савченко А.А. Показатели люцигенин- и люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов крови у больных раком почки. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 149. – №2. – С. 201-203. [Shkapova EA, Kurtasova LM, Savchenko AA. Lucigenin- and luminol-dependent chemiluminescence of blood neutrophils in patients with renal cancer. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2010;149(2):239-241. (In Russ.)].
  • Владимиров Ю.А., Проскурина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. // Успехи биологической химии. – 2009. — №49. — С.341-388. [Vladimirov YuA, Proskurina EV. Free radicals and cell chemiluminescence. Successes of biological chemistry. 2009;(49):341-388. (In Russ).].
  • Савченко А.А., Здзитовецкий Д.Э., Борисов А.Г., и др. Хемилюминесцентная активность нейтрофильных гранулоцитов и уровни концентрации цитокинов у больных распространенным гнойным перитонитом. // Цитокины и воспаление. – 2013. — Т.12. — №1-2. —С. 115-119. [Savchenko AA, Zdzitovetskiy DE, Borisov AG, et al. Neutrophil chemiluminescent activity and cytokine concentration levels in patients with extensive purulent peritonitis. Cytokines & inflammation. 2013;12(1-2):115-119. (In Russ.)].
  • Farrugia G, Bannister WH, Vassallo N, Balzan R. Aspirin-induced apoptosis of yeast cells is associated with mitochondrial superoxide radical accumulation and NAD(P)H oxidation. FEMS Yeast Res. 2013;13(8):755-768. doi: 10.1111/1567-1364.12075.
  • Кадричева С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А. Клеточно-метаболические механизмы дизрегуляционных нарушений в системе иммуно-эндокринных взаимосвязей при диффузном токсическом зобе. — Новосибирск: Наука; 2009. [Kadricheva SG, Savchenko AA, Dogadin SA. The cellular and metabolic mechanisms of disregulation disorders in the system of the immuno-endocrine interactions with diffuse toxic goiter. Novosibirsk: Nauka; 2009. (In Russ.)].
  • Mcaninch EA, Bianco AC. Thyroid hormone signaling in energy homeostasis and energy metabolism. Ann N Y Acad Sci. 2014;1311:77-87. doi: 10.1111/nyas.12374.
  • Sinha RA, Singh BK, Yen PM. Thyroid hormone regulation of hepatic lipid and carbohydrate metabolism. Trends Endocrinol Metab. 2014;25(10):538-545. doi: 10.1016/j.tem.2014.07.001.

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Views

Abstract - 753

PDF (Russian) - 59

Remote (Russian) - 12

PlumX


Copyright (c) Dogadin S.A., Dudina M.A., Savchenko A.A., Mankovskiy V.A., Gvozdev I.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.