Уважаемые пользователи!

Данный сайт содержит информацию для людей с медицинским образованием и специалистов здравоохранения.
Входя на сайт, Вы подтверждаете свое согласие с Условиями использования и Политикой конфиденциальности.



Dear visitor!
This site contains medical information for healthcare professionals.
You can go further, if you agree with Terms and Conditions and Privacy Policy on this site.

Modified quick parathyroid hormone test in surgery of primary hyperparathyroidism

Cover Page

Abstract


Aim.

The aim of the current study was the improvement of intraoperative quick parathyroid hormone (PTH) test, enabling to receive the results in a shorter period of time and to reduce the cost of the test, comparing with the existing methods.

Methods.

404 consecutive patients with primary hyperparathyroidism (PHPT) were included in the study. All patients were subjected to selective parathyroidectomy – by traditional or videoassisted technique. We performed two parathyroid tests – traditional and modified – in each patient. Blood was taken a) before skin incision, b) before cutting the parathyroid adenoma vessels and c) in 10 minutes after cutting the parathyroid adenoma vessels. We used immunochemiluminescent analyzer DiaSorin Liaison. Modified test for parathyroid hormone differed in the duration of reagents incubation – two times shorter than in traditional method, resulting in immune reaction break before plateau occurrence. The statistical analysis of the results was performed using Microsoft Excel 2010.

Results.

With 50% cut-off level for PTH level fall (between the maximal level – before operation or before cutting parathyroid adenoma vessels – and the level in 10 minutes after cutting the adenoma vessels), the sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value for modified test reached 92.73%, 60.00%, 97.81% and 30.00%, accordingly, comparing with 95.84%, 55.00%, 97.62% and 40.74% for conventional method. Cut-off level change to 40% improved the results of modified test application, and increased its sensitivity and negative predictive value (97.14%; 50.00%; 97.40%; 47.62%).

Conclusions.

2 times reduction of incubation time with cut-off level change to 40% allowed to cut the duration of intraoperative test for parathyroid hormone by half, and to improve diagnostic accuracy of the test, and at the same time to preserve low cost of the test.


Введение

Интраоперационное определение уровня паратгормона является ценным методом быстрого выявления персистенции заболевания при хирургическом лечении первичного гиперпаратиреоза. Значительное влияние на широту применения метода оказывают скорость получения результатов теста и его стоимость. Существующие в настоящее время коммерческие методы определения уровня паратгормона позволяют получить результат через 8–25 мин, при этом стоимость теста прогрессивно нарастает с сокращением времени до получения результата [1].

Наиболее широко распространенными сейчас являются методы определения паратгормона 2-го поколения (сэндвич-методы), при которых плазма крови, содержащая паратгормон, помещается в лунки с иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами. В ходе фазы 1-й инкубации паратгормон связывается с иммобилизированными антителами (рис. 1, а). В ходе фазы 2-й инкубации в лунки вносится раствор, содержащий специфические антитела к паратгормону, меченные энзимом (рис. 1, б). Во время инкубации происходит соединение молекул антител с молекулами паратгормона. Далее следует фаза промывки, удаляющая излишки реагентов (рис. 1, в). В последующем в лунку вносится субстрат, ферментативное расщепление которого приводит к возникновению флюоресценции, регистрируемой с использованием люминометра (рис. 1, г). Интенсивность флюоресценции коррелирует с количеством паратгормона в сыворотке крови, что дает возможность вычисления его абсолютной концентрации в единице объема [2].

Основные затраты времени при проведении исследования происходят во время фаз инкубации. Длительность данных этапов рассчитана таким образом, чтобы количество иммунных комплексов достигло максимально возможного уровня с формированием своеобразного плато (рис. 2). Промывка лунки начинается только после прекращения нарастания количества иммунных комплексов, что дает возможность вычисления точной концентрации уровня паратгормона в крови.

Одним из наиболее широко распространенных критериев оценки изменения уровня паратгормона является критерий Ирвина (критерий Майами) [3]. При этом время получения результатов интраоперационного анализа составляет не менее 10 мин, и к этому времени прибавляется время, необходимое для измерения уровня паратгормона. При длительности определения уровня паратгормона в 20 мин общая длительность ожидания результата критерия Майами составляет 30 мин (10 мин после отсечения сосудов аденомы + 20 мин на выполнение исследования). Увеличение длительности ожидания результатов теста более 30 мин делает методику интраоперационного контроля уровня паратгормона бесполезной с точки зрения практического применения, поскольку подобная длительность ожидания результата неприемлема для большинства хирургов [4].

Следует отметить, что интраоперационное определение уровня паратгормона имеет ряд существенных отличий от обычного теста на паратгормон как с точки зрения условий выполнения исследования, так и с точки зрения методики оценки его результатов.

При обычном определении уровня паратгормона крови целью исследования является получение в качестве результата абсолютной концентрации паратгормона в крови, выраженной в пг/мл или пмоль/л. Полученный в ходе анализа уровень паратгормона сопоставляется с другими результатами, полученными от данного пациента в течение его жизни, при этом все тесты выполняются в различные даты, различное время суток, зачастую – с использованием различного оборудования и наборов реагентов. Надежное сопоставление результатов анализа крови на паратгормон возможно только при точном соблюдении методики исследования, с достижением плато в ходе фаз инкубации и расчетом абсолютных значений концентрации паратгормона.

Задача интраоперационного определения уровня паратгормона крови – выявление разницы между прединцизионным и предэксцизионным уровнями паратгормона (максимальным из них), с одной стороны, и постэксцизионным (через 10 мин после удаления аденомы) уровнем паратгормона, с другой стороны. Фактически результат интраоперационного теста может быть выражен в процентах падения уровня паратгормона. Абсолютные значения уровня паратгормона при этом имеют вторичное значение – важна лишь разница между исходным и окончательным уровнями паратгормона, причем разница достаточно выраженная (в 2 раза). Важной особенностью интраоперационного исследования является практически одновременная постановка проб крови в анализатор (интервал времени между постановкой трех проб составляет около 10 мин), что делает условия выполнения теста практически идентичными – используется один и тот же анализатор, один и тот же набор реагентов в одних и тех же условиях окружающей среды.

На рис. 2 видно, что динамика изменения количества иммунных комплексов для прединцизионной (1-й) пробы крови и постэксцизионной (3-й) пробы крови значительно отличается с первых секунд фазы инкубации. Основной гипотезой данного исследования явилось предположение, что интраоперационный тест на паратгормон не требует обязательного достижения плато в ходе фазы инкубации, а информативность теста может сохраняться на высоком уровне в случае прерывания фазы инкубации через заданный стандартный интервал времени от ее начала.

Цель

Целью настоящего исследования явилась попытка подтверждения рабочей гипотезы путем оценки результатов применения интраоперационного теста на паратгормон с сокращенной в 2 раза от стандартной длительностью обеих фаз инкубации. Сокращение времени инкубации в 2 раза было выбрано произвольно. Теоретически возможно и более значительное сокращение длительности фаз инкубации, однако для целей исследования было выбрано именно 50%-ное сокращение, как достаточно показательное (рис. 3). При сокращении времени инкубации расчет абсолютной концентрации уровня паратгормона крови становится невозможным, в связи с чем результаты модифицированного теста выражались в RLU (Relative Light Units, единицы флюоресценции раствора после добавления субстрата). Суть исследования заключалась, таким образом, в сопоставлении разницы между максимальным из значений RLU1 и RLU2 в прединцизионной и предэксцизионной пробах крови, с одной стороны, и значением RLU3 в постэксцизионной пробе крови, с другой стороны. В качестве метода контроля был использован стандартный тест на паратгормон (PTH1 и PTH2 – прединцизионное и предэксцизионное значения, PTH3 – постэксцизионное значение).

Материал и методы

Исследование проведено в группе из 404 последовательных пациентов с первичным гиперпаратиреозом, проходивших лечение в клинике Северо-Западного центра эндокринологии и эндокринной хирургии в период с 2011 по 2013 г. В группе исследования преобладали женщины (377 пациентов; 93,3%), мужчины составили 6,7% (27 пациентов). Средний возраст пациентов женского пола составил 60,57 ± 10,85 лет, мужского пола – 53,56 ± 14,78 лет.

Диагноз у всех пациентов был подтвержден лабораторно путем определения уровня ионизированного кальция, паратгормона, фосфора крови, а также определения уровня кальция в суточной моче. Пациенты с синдромами множественной эндокринной неоплазии I и IIа типа были исключены из исследования. Локализация аденомы околощитовидной железы устанавливалась путем проведения ультразвукового исследования (УЗИ) шеи хирургом-эндокринологом и выполнения сцинтиграфии с технетрилом (MIBI). У пациентов с дискордантными результатами УЗИ и MIBI выполнялась компьютерная томография (КТ) шеи и верхнего средостения с болюсным контрастным усилением.

Операция по удалению аденомы околощитовидной железы проводилась под общей анестезией, стандартным или видеоассистированным путем. У пациентов с наличием двух конкордантных результатов визуализирующих исследований (УЗИ и MIBI, УЗИ и КТ, MIBI и КТ) проводилась селективная паратиреоидэктомия без визуализации остальных околощитовидных желез. В случае наличия дискордантных или неинформативных результатов визуализирующих исследований проводилась двусторонняя ревизия шеи.

Пробы венозной крови брались до разреза кожи (первая, прединцизионная проба), до отсечения или клипирования сосудов аденомы околощитовидной железы (вторая, предэксцизионная проба), через 10 мин после отсечения или клипирования сосудов аденомы (третья, постэксцизионная проба).

Лабораторный этап исследования проводили с использованием иммунохемилюминесцентного анализатора Liaison (DiaSorin, Италия).

Всем пациентам проводились одновременно стандартный и модифицированный тесты на паратгормон. Стандартное исследование уровня паратгормона крови проводили по обычной программе (общая длительность – 25 мин). Модифицированный тест проводили с сокращением времени теста за счет фаз инкубации до достижения общей длительности теста в 12 мин, результаты выражали в RLU.

Результаты теста считали положительными при регистрации падения уровня ПТГ или RLU между максимальным значением до удаления аденомы (в первой или второй пробе) и значением в третьей пробе на 50% или более. Также проводили расчет результатов применения теста для порогового значения в 40% или более. При этом операцию завершали независимо от результатов теста. Проводили контроль уровня паратгормона и ионизированного кальция крови через 4 ч после операции и утром первого послеоперационного дня. Персистенцию гиперпаратиреоза регистрировали по сохранению повышенного уровня паратгормона и ионизированного кальция крови в послеоперационном периоде. Пациентам с персистенцией гиперпаратиреоза проводили дополнительные визуализирующие исследования (КТ, УЗИ, MIBI), после чего выполняли повторное вмешательство в объеме двусторонней ревизии шеи.

В ходе исследования оценивали результаты применения теста для выявления персистенции гиперпаратиреоза. Для оценки результатов применяли понятия об истинности или ложности теста в соответствии с табл. 1.

Положительное предсказательное значение определяли как отношение истинноположительных результатов к сумме истинноположительных и ложноположительных результатов, выраженное в процентах.

Отрицательное предсказательное значение определяли как отношение истинноотрицательных результатов к сумме истинноотрицательных и ложноотрицательных результатов, выраженное в процентах.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel 2010.

Результаты

Результаты применения стандартного теста для выявления послеоперационной персистенции гиперпаратиреоза при использовании порогового значения в 50% или более и 40% или более приведены в табл. 2.

Результаты применения модифицированного теста при использовании порогового значения в 50% или более и 40% или более приведены в табл. 3.

Общие статистические показатели обоих тестов для двух вариантов пороговых значений приведены в табл. 4.

Обсуждение

Основное предназначение интраоперационного определения уровня паратгормона крови – это выявление персистенции гиперпаратиреоза вследствие наличия дополнительных аденом околощитовидных желез или множественной их гиперплазии. Сам по себе интраоперационный тест является тестом исключающим – положительный результат теста (падение уровня паратгормона ниже порогового значения) должен исключать наличие персистенции гиперпаратиреоза.

Падение уровня паратгормона крови во время операции ниже порогового значения свидетельствует об отсутствии дополнительных источников патологической продукции паратгормона, что дает возможность завершить операцию после проведения селективной паратиреоидэктомии – удаления только аденоматозно измененной околощитовидной железы, без ревизии остальных желез. Отсутствие падения уровня паратгормона позволяет заподозрить наличие дополнительных аденом или гиперплазии, что требует от хирурга перехода к проведению двусторонней ревизии шеи.

Чувствительность метода интраоперационного определения уровня паратгормона определяет процент пациентов с единственной аденомой околощитовидной железы, выявленных с использованием метода (т.е. является отношением истинноположительных результатов к сумме истинноположительных и ложноотрицательных). Чем выше чувствительность метода, тем меньшее число пациентов с единственной аденомой околощитовидной железы будет подвергнуто ненужной для них операции – двусторонней ревизии шеи.

Специфичность метода срочного определения паратгормона определяется процентом пациентов с наличием дополнительных аденом или гиперплазией околощитовидных желез, выявленных с использованием метода (отношение истинноотрицательных результатов теста к сумме истинноотрицательных и ложноположительных). С клинической точки зрения, чем выше специфичность метода, тем большему числу пациентов с персистенцией гиперпаратиреоза данный диагноз будет установлен интраоперационно, что позволит сразу провести им излечивающую процедуру – двустороннюю ревизию шеи. Специфичность определяет также процент пациентов, которым потребуется повторное вмешательство в объеме двусторонней ревизии шеи (в случае ошибки метода и падения уровня паратгормона ниже порогового значения во время операции).

Основной причиной появления ложноотрицательных результатов теста, при которых отсутствует падение уровня паратгормона ниже порогового значения, является медленное разрушение паратгормона в крови у части пациентов. В данной группе пациентов улучшение результатов применения теста возможно либо путем увеличения интервала времени между удалением аденомы и взятием 3-й пробы крови, либо путем снижения порогового значения уровня паратгормона, при котором тест считается положительным. Увеличение интервала времени является простым, но нежелательным способом, поскольку время до получения результата определяет практическую применимость метода в целом (при необходимости излишне длительного ожидания результата хирурги просто прекращают использовать тест, поскольку он значительно замедляет их работу). Логичным решением может стать снижение порогового значения теста, но и этот метод имеет свои ограничения – излишнее снижение порога чревато снижением специфичности метода.

У части пациентов, имеющих две или более автономно функционирующие околощитовидные железы, после удаления одной из желез происходит снижение уровня паратгормона крови ниже порогового значения. Данный феномен возникает вследствие супрессии “лидирующей” аденомой остальных, также аденоматозно измененных околощитовидных желез. Именно этим фактом определяется редкость выявления двойных аденом при проведении сцинтиграфии с технетрилом (MIBI). После удаления наиболее функционально активной аденомы другие железы начинают выделять паратгормон, однако время возвращения их функциональной активности может варьировать в широких пределах – до нескольких часов. В связи с этим теоретическая специфичность интраоперационного теста не может быть 100%-ной. Вместе с тем ложное снижение уровня паратгормона у пациента с персистенцией гиперпаратиреоза не приводит к тяжелым последствиям – пациенту требуется повторное оперативное вмешательство, однако оно является вполне оправданным и обычно излечивает пациента. Значительно более опасным и нежелательным является отсутствие снижения уровня паратгормона у пациента с отсутствием дополнительных аденом, поскольку в подобном случае пациенту проводится расширенное вмешательство, клинически совершенно не оправданное и чреватое повышением риска осложнений.

Таким образом, для интраоперационного теста на паратгормон с клинической точки зрения важной является максимально высокая чувствительность в сочетании с приемлемой специфичностью.

Стандартная методика определения паратгормона крови ставит своей задачей вычисление абсолютного значения концентрации паратгормона, выраженной в тех или иных единицах измерения (пг/мл или пмоль/л). Для достижения указанной задачи необходимо строгое соблюдение методики проведения иммунохемилюминесцентного теста, с выделением для фаз инкубации реагентов времени, достаточного для достижения максимально возможного количества иммунных комплексов “паратгормон–антитело” (выхода кривой нарастания количества комплексов на плато). Для интраоперационного же теста абсолютный уровень паратгормона в целом не важен, поскольку для принятия решения о результате теста достаточно знать разницу между максимальным исходным и окончательным уровнями паратгормона.

В ходе настоящего исследования было показано, что уже через 1/2 стандартного времени инкубации возможно получение результатов, близких к результатам традиционного теста. Данный факт является подтверждением гипотезы, что максимальное нарастание числа иммунных комплексов происходит в течение первых секунд инкубации, с последующим замедлением динамики образования подобных комплексов. Сокращение времени инкубации на 50% значительно снижает затраты времени на получение результата теста, при отсутствующих затратах средств (не требуется ни замены оборудования, ни замены реагентов, методика измерения меняется программным путем). Вполне возможно, что дальнейшее сокращение времени инкубации также является допустимым, однако в цели настоящего исследования не входил подбор оптимального времени инкубации, целью являлась лишь проверка гипотезы о том, что сокращение инкубации принципиально является возможным. Результат исследования показывает, что возможно как минимум двукратное сокращение времени ожидания результатов теста (для стандартных тестов – с 25 до 12 мин, для срочных тестов на паратгормон – с 8–10 до 4–5 мин) без потери функциональной чувствительности исследования.

Сокращение порогового значения теста до 40% привело к улучшению чувствительности и стандартного, и модифицированного тестов при умеренном снижении их специфичности и высоких показателях положительного и отрицательного предсказательных значений. Вероятнее всего, данный феномен был достигнут за счет обеспечения положительных результатов теста и у пациентов с замедленным метаболизмом паратгормона. Важно отметить, что при использовании порогового значения в 40% модифицированный тест показал результаты, очень близкие к результатам стандартного теста при пороге в 50% (классический критерий Майами), при вдвое меньшем времени получения результата.

В ходе исследования было показано, что динамика нарастания количества иммунных комплексов “паратгормон–антитело” прямо коррелирует с результатами применения интраоперационного теста. Результаты исследования дают возможность разработки методов оценки количества образующихся иммунных комплексов “паратгормон–антитело” в режиме онлайн, с получением информации о достижении диагностически значимых различий между пробами крови до и после удаления аденомы в течение максимально короткого времени (возможно – в течение секунд после начала реакции). Пример подобной реакции приведен на рис. 5. Наиболее вероятный путь для разработки подобных тестов – использование конкурентного иммуноферментного или иммунохемилюминесцентного анализа с постоянной динамической регистрацией оптической плотности или люминесценции зоны реакции.

Методика интраоперационного исследования с сокращенным временем инкубации реагентов получила патент Российской Федерации на изобретение (2438129 RU С1 от 27.12.2010) [5].

Выводы

Методика модифицированного интраоперационного теста на паратгормон с сокращением времени инкубации реагентов на 50% обеспечивает сходные результаты по сравнению с традиционным методом измерения уровня паратгормона крови в оперативном лечении пациентов с первичным гиперпаратиреозом. При этом модифицированная методика обеспечивает сокращение времени до получения результата теста в 2 раза без увеличения расходов на проведение исследования и без потребности в замене оборудования или реагентов.

Сокращение порогового значения теста до 40% приводит к повышению чувствительности теста при приемлемом снижении специфичности и сохранении высоких положительного и отрицательного предсказательных значений.

Сокращение времени инкубации реагентов при интраоперационном определении уровня паратгормона крови является перспективным способом снижения общих затрат времени на проведение исследования.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Исследование проведено при поддержке Северо-Западного центра эндокринологии и эндокринной хирургии (Санкт-Петербургский многопрофильный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации) и Санкт-Петербургского государственного университета.

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией статьи. 

I. V. Sleptsov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center; Saint Petersburg State University

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

N. B. Vybornova

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

R. A. Chernikov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD,PhD

A. A. Semenov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center; Saint Petersburg State University

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD,PhD

N. I. Timofeeva

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD,PhD

I. K. Chinchuk

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

V. A. Makarin

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Author for correspondence.
Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

K. Y. Novokshonov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

E. A. Fedorov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

A. A. Uspenskaya

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

J. V. Karelina

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

Y. N. Malyugov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

M. O. Nikulin

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

A. V. Belov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

A. R. Bahtijarova

Saint Petersburg State University

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

A. N. Bubnov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center; Saint Petersburg State University

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

Y. N. Fedotov

North-Western Center of Endocrinology and Endocrine Surgery; Saint-Petersburg Multidisciplinary Center

Email: info@vmakarin.ru

Russian Federation MD, PhD

  1. Nelson CM, Victor NS. Rapid intraoperative parathyroid hormone assay in the surgical management of hyperparathyroidism. Perm J. 2007;11(1):3-6.
  2. Carter AB, Howanitz PJ. Intraoperative testing for parathyroid hormone: a comprehensive review of the use of the assay and the relevant literature. Arch Pathol Lab Med. 2003;127(11):1424-1442. doi: 10.1043/1543-2165(2003)127<1424:ITFPHA>2.0.CO;2.
  3. Barczynski M, Golkowski F, Nawrot I. The current status of intraoperative iPTH assay in surgery for primary hyperparathyroidism. Gland Surg. 2015;4(1):36-43. doi: 10.3978/j.issn.2227-684X.2015.01.01.
  4. Sokoll LJ, Wians FH, Jr., Remaley AT. Rapid intraoperative immunoassay of parathyroid hormone and other hormones: a new paradigm for point-of-care testing. Clinical chemistry. 2004;50(7):1126-1135. doi: 10.1373/clinchem.2003.030817.
  5. Слепцов И.В. Патент на изобретение 2438129 RU С1. Способ лечения гиперпаратиреоза / Слепцов И.В., Одинцов В.А., Черников Р.А., Успенская А.А., Шумакович И.С., Новокшонов К.Ю. (Россия). – №2010154708. – Приоритет 27.12.2010; опубл. 20.06.2011. [Sleptsov IV. Patent 2438129 RU S1. Sposob lecheniya giperparatireoza (Russia). 27.12.2010.]

Views

Abstract - 1571

PDF (Russian) - 401


Copyright (c) 2016 Слепцов И.В., Выборнова Н.Б., Черников Р.А., Семенов А.А., Тимофеева Н.И., Чинчук И.К., Макарьин В.А., Новокшонов К.Ю., Федоров Е.А., Успенская А.А., Карелина Ю.В., Малюгов Ю.Н., Никулин О.М., Бубнов А.Н., Федотов Ю.Н., Белов В.А., Бахтиярова А.Р.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.